在液相色譜分析中，
二元高壓梯度系統(tǒng)憑借其高精度、高重現(xiàn)性的優(yōu)勢(shì)，已成為復(fù)雜樣品分離分析的首要選擇技術(shù)。梯度程序的正確設(shè)定與優(yōu)化，直接決定了分離效果、分析效率和結(jié)果的可靠性。本文將系統(tǒng)闡述二元高壓梯度系統(tǒng)梯度程序的設(shè)定方法、關(guān)鍵參數(shù)調(diào)整策略以及常見問題的解決方案，為分析工作者提供一套完整的操作指南。
一、梯度程序設(shè)定的基礎(chǔ)準(zhǔn)備
1.系統(tǒng)配置確認(rèn)是設(shè)定梯度程序的第一步。二元高壓梯度系統(tǒng)由兩臺(tái)高壓泵、在線混合器、色譜柱和檢測(cè)器組成。在開始設(shè)定前，需確認(rèn)：
①兩臺(tái)泵分別連接正確的流動(dòng)相；
?、诠苈愤B接無泄漏，溶劑已充分脫氣；
?、凵V柱類型與流動(dòng)相兼容；
?、芟到y(tǒng)已完成排氣和平衡操作。這些基礎(chǔ)準(zhǔn)備工作是確保梯度程序準(zhǔn)確執(zhí)行的前提。
2.軟件界面熟悉至關(guān)重要。不同品牌儀器的工作站軟件界面略有差異，但核心功能模塊相似。通常包括：泵參數(shù)設(shè)置、梯度程序表、檢測(cè)器參數(shù)、柱溫箱設(shè)置等。建議初次使用者先通過軟件模擬功能預(yù)覽梯度曲線，確認(rèn)設(shè)置無誤后再執(zhí)行實(shí)際運(yùn)行。
二、梯度程序的核心參數(shù)設(shè)定方法
1.初始條件設(shè)定
初始條件決定了梯度洗脫的起點(diǎn)。在二元系統(tǒng)中，流動(dòng)相A和B的初始比例總和必須為100%。例如，若采用乙腈-水體系，初始比例可設(shè)為A泵（水）95%、B泵（乙腈）5%。初始比例的選擇需考慮樣品中最早洗脫組分的保留特性——若初始有機(jī)相比例過高，可能導(dǎo)致弱保留組分過早洗脫，分離度不足；若過低，則可能延長(zhǎng)分析時(shí)間。一般建議根據(jù)預(yù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果或文獻(xiàn)方法確定初始比例，對(duì)于未知樣品可從低有機(jī)相比例（如5%）開始探索。
2.梯度時(shí)間與斜率設(shè)置
梯度時(shí)間（tG）指從初始比例變化到終止比例所需的時(shí)間，直接影響分離效率和峰容量。梯度斜率（即單位時(shí)間內(nèi)有機(jī)相比例的變化率）的計(jì)算公式為：斜率=(B終-B初)/tG。例如，從5%乙腈到95%乙腈，梯度時(shí)間20分鐘，則斜率為4.5%/min。
設(shè)定原則：
?、賹?duì)于組分極性差異大的復(fù)雜樣品，應(yīng)采用較長(zhǎng)的梯度時(shí)間（如30-60分鐘）和緩和的斜率，以提高分離度；
?、趯?duì)于簡(jiǎn)單樣品或高通量分析，可采用短梯度時(shí)間（5-10分鐘）和陡峭斜率，縮短分析周期；
?、廴裟繕?biāo)組分集中在某一時(shí)間段出峰，可采用分段梯度——在關(guān)鍵區(qū)域放緩斜率，其他區(qū)域快速變化，實(shí)現(xiàn)"局部?jī)?yōu)化"。實(shí)際設(shè)定時(shí)，可在工作站軟件中直接輸入時(shí)間點(diǎn)對(duì)應(yīng)的B泵濃度，系統(tǒng)會(huì)自動(dòng)計(jì)算斜率。
3.終止條件與平衡時(shí)間
梯度程序結(jié)束時(shí)，通常需要設(shè)置一段"保持時(shí)間"，使流動(dòng)相比例穩(wěn)定在終止比例，確保所有組分全部洗脫。隨后，系統(tǒng)應(yīng)自動(dòng)切換回初始比例，并保持足夠時(shí)間進(jìn)行柱平衡，為下一次進(jìn)樣做準(zhǔn)備。若平衡不充分，會(huì)導(dǎo)致保留時(shí)間漂移、峰形變差?，F(xiàn)代工作站軟件通常提供"自動(dòng)平衡"功能，可根據(jù)系統(tǒng)延遲體積自動(dòng)計(jì)算所需平衡時(shí)間。
4.流速與壓力參數(shù)
二元高壓梯度系統(tǒng)的總流速由兩臺(tái)泵的流速之和決定。流速設(shè)置需考慮色譜柱規(guī)格和系統(tǒng)耐壓上限。對(duì)于常規(guī)分析柱，流速通常設(shè)為1.0mL/min；對(duì)于UPLC系統(tǒng)或小內(nèi)徑柱，流速相應(yīng)降低。壓力上限應(yīng)設(shè)置為色譜柱和系統(tǒng)允許的最大壓力的80%左右，以保護(hù)色譜柱和泵系統(tǒng)。梯度洗脫過程中，由于流動(dòng)相組成變化，系統(tǒng)壓力會(huì)隨之波動(dòng)，這是正?，F(xiàn)象，但需監(jiān)控壓力曲線是否平穩(wěn)，避免劇烈波動(dòng)。
三、梯度程序的優(yōu)化調(diào)整策略
1.基于分離效果的參數(shù)調(diào)整
當(dāng)初始梯度程序運(yùn)行后，若出現(xiàn)以下問題，需針對(duì)性調(diào)整：
?、俜蛛x度不足：若目標(biāo)峰與相鄰雜質(zhì)峰未全部分離，可嘗試：延長(zhǎng)梯度時(shí)間，降低斜率、在目標(biāo)峰出峰區(qū)域設(shè)置"平臺(tái)"，增加該區(qū)域的分離時(shí)間、調(diào)整初始或終止比例，改變目標(biāo)峰的保留位置，避開干擾峰。
?、诜逍瓮衔不蚯吧欤嚎赡苁橇鲃?dòng)相pH或緩沖鹽濃度不匹配，需優(yōu)化流動(dòng)相添加劑，而非單純調(diào)整梯度程序。
?、郾Ａ魰r(shí)間漂移：檢查柱溫是否穩(wěn)定、流動(dòng)相是否充分平衡、系統(tǒng)延遲體積是否準(zhǔn)確校準(zhǔn)。若為系統(tǒng)性問題，需重新平衡色譜柱或檢查泵的混合精度。
2.梯度曲線類型的靈活運(yùn)用
除線性梯度外，二元高壓梯度系統(tǒng)還支持多種曲線類型，可根據(jù)分離需求選擇：
?、偻剐翁荻龋浩鹗甲兓欤笃谧兓?，適用于早期組分分離度差、后期組分易分離的樣品。
?、诎夹翁荻龋浩鹗甲兓?，后期變化快，適用于早期組分易分離、后期組分難分離的樣品。
③階梯梯度：在特定時(shí)間點(diǎn)直接切換比例，適用于組分極性差異極大的樣品，但可能引起基線波動(dòng)。
大多數(shù)工作站軟件提供"梯度曲線編輯器"，可通過拖拽曲線上的控制點(diǎn)來調(diào)整梯度形狀，實(shí)現(xiàn)更精細(xì)的優(yōu)化。
3.系統(tǒng)延遲體積的校正
系統(tǒng)延遲體積會(huì)影響梯度程序的"實(shí)際執(zhí)行時(shí)間"。若未校正，會(huì)導(dǎo)致保留時(shí)間滯后。校正方法：
①查閱儀器說明書獲取標(biāo)準(zhǔn)延遲體積值；
②通過實(shí)驗(yàn)測(cè)定——運(yùn)行一個(gè)從0%到100%的快速梯度，記錄檢測(cè)器響應(yīng)時(shí)間與程序設(shè)定時(shí)間的差值，計(jì)算實(shí)際延遲體積?，F(xiàn)代儀器通常內(nèi)置自動(dòng)校正功能，在軟件中輸入實(shí)際延遲體積后，系統(tǒng)會(huì)自動(dòng)補(bǔ)償，確保梯度程序準(zhǔn)確執(zhí)行。
四、常見問題與解決方案
1.基線漂移或波動(dòng)：梯度洗脫中，若兩種流動(dòng)相的紫外吸收差異較大，易導(dǎo)致基線漂移。解決方案：
?、偈褂酶呒兌热軇?，減少雜質(zhì)干擾；
?、谠跈z測(cè)器前增加參比池，進(jìn)行基線扣除；
?、廴羝茋?yán)重，可考慮使用緩沖鹽或添加劑平衡紫外吸收，或改用其他檢測(cè)波長(zhǎng)。
2.壓力異常波動(dòng)：梯度過程中壓力劇烈波動(dòng)可能原因：
?、倭鲃?dòng)相混合不均勻，產(chǎn)生氣泡；
?、诒妹芊馊δp；
?、刍旌掀鞫氯Ｐ铏z查溶劑脫氣是否充分、泵頭是否漏液、混合器是否需清洗。
3.重現(xiàn)性差：若多次運(yùn)行同一梯度程序，保留時(shí)間或峰面積差異大，需檢查：
?、倭鲃?dòng)相配制是否準(zhǔn)確（建議使用稱量法而非體積法）；
?、谥鶞厥欠穹€(wěn)定；
?、郾玫幕旌暇仁欠襁_(dá)標(biāo)（可通過運(yùn)行空白梯度驗(yàn)證）；
?、苌V柱是否老化或污染。
結(jié)語
二元高壓梯度系統(tǒng)的梯度程序設(shè)定是一項(xiàng)理論與實(shí)踐相結(jié)合的技術(shù)。掌握基礎(chǔ)參數(shù)設(shè)置方法、理解梯度曲線對(duì)分離的影響、學(xué)會(huì)基于色譜圖反饋進(jìn)行針對(duì)性優(yōu)化，是提升分析質(zhì)量的關(guān)鍵。建議初學(xué)者從簡(jiǎn)單線性梯度開始，逐步嘗試分段梯度、曲線梯度等復(fù)雜程序，通過實(shí)際樣品反復(fù)驗(yàn)證，積累經(jīng)驗(yàn)。隨著對(duì)樣品性質(zhì)、色譜柱特性和儀器性能的深入理解，梯度程序的設(shè)定將更加得心應(yīng)手，最終實(shí)現(xiàn)高效、精準(zhǔn)的分離分析目標(biāo)。
